ICS 67.050
X 04
中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
GB/T 18979-2003
食品中黃曲霉毒素的測(cè)定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和 熒 光 光 度 法
De te r m in at io n a fla to xins content
Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy
in foodand
determination by
high-performance liquid chromatigraphy and fluorometer
2003-02-21發(fā)布2003-08-01實(shí)施
雄 宙嘉 k Wi A * 1 M 發(fā)布
GB/T 18979-2003
月明青
本標(biāo)準(zhǔn)由北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。
本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所、青島出人境檢驗(yàn)檢疫局、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人:王晶、張鵬、張藝兵、邵明武。
本標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)布。
GB/T 18979-2003
食 品 中黃 曲霉毒素的測(cè)定
免疫親和層析凈化液相色譜法
和 熒 光 光 度 法
范圍
本 標(biāo) 準(zhǔn) 規(guī)定了免疫親和層析凈化一液相色譜法和免疫親和層析凈化一熒光光度法測(cè)定食品中
黃曲霉毒素的條件和詳細(xì)分析步驟。
本 標(biāo) 準(zhǔn) 適用于玉米、花生及其制品(花生醬、花生仁、花生米)、大米、小麥、植物油脂、醬油、食醋等食
品中黃曲霉毒素的測(cè)定。
樣 品 中 黃曲霉毒素的檢出限:免疫親和層析凈化一液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B;以及黃曲霉
毒素B,,玖,G,,G ?？偭繖z出限為 1k g/kg。免疫親和層析凈化一熒光光度法測(cè)定黃曲霉毒素B氏、
G,,G 總量檢出限為 1m g/kg,醬油樣品中檢出限為2.5 p g/kg.
2 免疫親和層析凈化液相色譜法
2.1 方法提要
試 樣 經(jīng) 過(guò)甲醇一水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析
凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素BBz,GG:具有專(zhuān)一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水
或吐溫-20/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過(guò)帶熒光檢測(cè)器
的液相色譜儀柱后碘溶液衍生測(cè)定黃曲霉毒素的含量。
2.2 試劑和溶液
除非 另 有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?、重蒸餾水。
2.2.1 甲醇(CH,OH):色譜純。
2.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
2.2.3 甲醇一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
2.2.4 甲醇一水(45+55):取45 mL甲醇加55 mL水。
2.2.5 苯:色譜純。
2.2.6 乙睛:色譜純。
2.2.7 苯一乙睛(98+2):取2 mL乙睛加98 mL苯。
2.2.8 抓化鈉(NaCI),
2.2.9 磷酸氫二鈉(NaiH PO,),
2.2. 10 磷酸二氫鉀(KHzP04).
2.2. 11 氯化鉀(KCl) e
2.2 .1 2 PBS緩沖溶液:稱(chēng)取 8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉，0.2 g 磷酸二氫鉀，0.2 g 抓化鉀，用
990 mL純水溶解，然后用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0，zui后用純水稀釋至1 000 ML.
2.2.1 3 吐溫-20/PBS溶液(0.1 00):取 1m l一吐溫-20，加人 PBS緩沖溶液并定容至 10 00m L,
2.2.1 4 pH7.0磷酸鹽緩沖溶液:取 25.0 m L 0.2 m ol/L的磷酸二氫鉀溶液與 29.1 m L 0.1 m ol/L的
氫氧化鈉溶液混勻后，稀釋到100 mL.
GB/T 18979- 2003
2.2. 15 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品(黃曲霉毒素BB2,GG):純度)9900
2-2. 16 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:用苯一乙睛(98+2)溶液分別配制。. 100 mg/mL的黃曲霉毒素B, ,
B2,G,,G:標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/span>
2.2. 17 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:準(zhǔn)確移取適量的黃曲霉毒素BB 2,G G:標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用苯一乙
睛(98+2)溶液稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。
2.2. 18 柱后衍生溶液(0.05%碘溶液):稱(chēng)取。. 1 g碘，溶解于20 mL甲醇后，加純水定容至200 mL,
以0. 45 jam的尼龍濾膜過(guò)濾,4℃避光保存。
2.3 儀器和設(shè)備
實(shí) 驗(yàn) 室 常規(guī)儀器、設(shè)備及下列各項(xiàng)。
2.3. 1 高速均質(zhì)器:18 000 r/min-22 000 r/mine
2.3.2 黃曲霉毒素免疫親和柱。
2.3.3 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1. 5 pme
2.3.4 玻璃注射器:10 mL,20 mLa
2.3.5 玻璃試管:直徑12 mm，長(zhǎng)75 mm，無(wú)熒光特性。
2.3.6 液相色譜儀:具有360 nm激發(fā)波長(zhǎng)和大于420 nm發(fā)射波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)器。
2.3.7 空氣壓力泵。
2.3.8 微量注射器:100 KLe
2.3.9 色譜柱:C,，柱(柱長(zhǎng)150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，填料直徑5 pm) e
2.4 分析步驟
2.4. 1 提取
2.4.1.1 大米、玉米、小麥、花生及其制品:準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)磨細(xì)(粒度小于2 mm)的試樣25. 0 g于
250 mL具塞錐形瓶中，加人5. 0 g氯化鈉及甲醇一水(7+3)至125.0 mL(V,)，以均質(zhì)器高速攪拌提取
2 min。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取15.0 mL(V2)濾液并加人30.0 mL(V,)水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾
1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1 .2 植物油脂:準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣 25.0 g 于 250m L具塞錐形瓶中，加人 5.0 g 氯化鈉及加人甲醇一水
(7+3)至 125.0m L(V,)，以均質(zhì)器高速攪拌提取 2m in。定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取 15.0 M l-(V2)濾液
并加人30. 0 mL(磯)水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.3 醬油:準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣 50.0 g 于 250.0 mL具塞錐形瓶中，加人 2.5 g氯化鈉及加人甲醇一水
(8十2)至100.0 mL(V4)，以均質(zhì)器高速攪拌提取1 mine定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取10. 0 mL(V )濾液
并加人40.0 mL(V,)水稀釋?zhuān)貌ＡЮw維濾紙過(guò)濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.1.4 食醋:準(zhǔn)確稱(chēng)取 5.0 g 樣品，加人 1.0 g 氯化鈉，以pH7.0 磷酸鹽緩沖溶液稀釋至 25.0 m L
(V,),混勻，定量濾紙過(guò)濾。取 10.0 nt L(磯)濾液加人 10.0m L(認(rèn) )緩沖液，混勻，以玻璃纖維濾紙過(guò)
濾1-2次，至濾液澄清，備用。
2.4.2 凈化
2.4.2. 1 大米、玉米、小麥、花生及其制品、植物油脂:將免疫親和柱連接于20. 0 ml玻璃注射器下。
準(zhǔn)確移取15.0 mL(V4)樣品提取液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使
溶液以約6 mI./min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。以10 mL水淋洗柱
子兩次，棄去全部流出液，并使2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加人1.0 mL(V)色譜級(jí)甲醇洗脫，流
速為1 mL/min-2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
2.4.2.2 醬油:將免疫親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取 10.0 mL(叭)醬油樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過(guò)
免疫親和柱。用10 mL 0. 1腸的吐溫一20/PBS清洗，再以10 m1_水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，并
使2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加人1.0 mL<V)色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1 mL/min-2 mL/min,
GB/T 18979-2003
收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
2.4.2.3 食醋:將免疫親和柱連接于 10.0 m L玻璃注射器下。準(zhǔn)確移取 10.0 mL(V,)食醋樣品提取
液注人玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約6 ml-/min流速緩慢通過(guò)
免疫親和柱，用10 mL 0. 1寫(xiě)的吐溫-20/PBS溶液清洗，再以10 mL水清洗柱子兩次，棄去全部流出液，
并使2 mL-3 mL空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1.0 mL(V)色譜級(jí)甲醇洗脫，流速為1 mL/min-
2 mL/min，收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測(cè)用。
2.4.3 測(cè)定
2.4.3. 1 液相色譜條件
流 動(dòng) 相 :甲醇一水(45+55)
流速 : 。 8M L/min
柱 后 衍 生化系統(tǒng)
衍 生 溶 液:。.05%碘溶液
衍 生 溶 液流速:0.2 m L/min
反 應(yīng) 管 溫度:700C
反 應(yīng) 時(shí) 間:1m in
2.4.3.2 定量
用進(jìn) 樣 器 吸取100p L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(2.2.17)注人液相色譜儀，在上述色譜條件
下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值(峰高或峰面積)，得到黃曲霉毒素BB2,G,,G:標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖。
參考譜圖見(jiàn)圖1.
面暇肆憐粗權(quán)
卜國(guó)權(quán)盼姍目權(quán)八
一。妞贊甘扭權(quán)八n曰曰
翻。暇麟崢祖枉
41Fka20
招16 14 招10 8
保留時(shí)間/min
圖 1 黃 曲 霉 毒 素 B, ,B 2, G G 2 的 標(biāo) 準(zhǔn) 譜 圖
取 樣 品 洗脫液 1.0 m L加人重蒸餾水定容至 2.0 m L，用進(jìn)樣器吸取 100p L注人液相色譜儀，
在上述色譜條件下測(cè)定試樣的響應(yīng)值(峰高或峰面積)。經(jīng)過(guò)與黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖比較響應(yīng)值得
到試樣中黃曲霉毒素 B,、 B2 ,G ,和G:的濃度 :。
2.4.4 空白試驗(yàn)
用 水 代 替試樣，按 2.4.1-2.4.3步驟做空白試驗(yàn)。
2.4.5 結(jié)果計(jì)算
樣 品 中 黃曲霉毒素 BB2,G 1或 G:的含量(X,)以微克每千克表示，按式(1)計(jì)算:
(c:一ca )·V
W
(1)
GB/T 18979- 2003
其中:
w一署X(v 開(kāi)3)XV 4 ，....... . 。.·....···. . (2)
式中:
X,— 樣品中黃曲霉毒素B, ,氏,G，或G:的含量，單位為微克每千克伽g/kg);
c,— 試樣中黃曲霉毒素BB,,G，或G:的含量，單位為微克每升(pg/L) ;
‘。— 空白試驗(yàn)黃曲霉毒素BB2,G，或G:的含量，單位為微克每升(f'g/L );
V— zui終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— zui終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，單位為克〔9);
，— 試樣稱(chēng)取的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克(g);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(mL) ;
V2 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V3 稀釋液體積，單位為毫升(mL) ;
叭通過(guò)親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) ,
黃曲霉毒素總量為BB2,G,,G2的濃度之和，即B,+ B2+ G,+ G2,
計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后兩位。
免疫親和層析凈化熒光光度法
3.1 方法提要
試 樣 經(jīng) 過(guò)甲醇一水提取，提取液經(jīng)過(guò)濾、稀釋后，濾液經(jīng)過(guò)含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析
凈化，此抗體對(duì)黃曲霉毒素 B B2, G G:具有專(zhuān)一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水
將免疫親和柱上雜質(zhì)除去.以甲醇通過(guò)免疫親和層析柱洗脫，加人澳溶液衍生，以提高測(cè)定靈敏度。洗
脫液通過(guò)熒光光度計(jì)測(cè)定黃曲霉毒素(B,+ 玖+G,十G2)總量。
3.2 試劑和溶液
除非 另 有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭⒅卣麴s水
3.2.1 甲醇(CH30H):色譜純。
3.2.2 甲醇一水(7+3):取70 mL甲醇加30 mL水。
3.2.3 甲醉一水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。
3.2.4 抓化鈉(NaCD,
3.2.5 磷酸氫二鈉(NatH PO,) 。
3.2.6 磷酸二氫鉀(KH2P O,)o
12. 7 氯化鉀(KCl)
3.2.8 澳溶液儲(chǔ)備液(0.0 1%):稱(chēng)取適量澳，溶于水，配成 0.01%的儲(chǔ)備液，40C避光保存。
3.2.9 澳溶液工作液(0.002寫(xiě)):取 10m L0 .0 1%的澳溶液加人 40m L水混勻，于棕色瓶中保存?zhèn)溆谩?/span>
需每次使用前配制。
3.2.1 0 二水硫酸奎寧(C,oH z,N zO z·H2SO4，2Hz0),
3.2.1 1 硫酸溶液(0.0 5m ot/L):取 2.8 m L濃硫酸，緩慢加人適量水中，冷卻后定容至 10 00m L.
3.2.12 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液:稱(chēng)取3.40 g 硫酸奎寧(CzoH z,N ,0 2·HzS04·2H20)用0.0 5m ot/L硫
酸溶液稀釋至100 mL，此溶液熒光光度計(jì)讀數(shù)相當(dāng)于20 has/L黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3. 3 儀器和設(shè)備
實(shí) 驗(yàn) 室 常規(guī)儀器、設(shè)備及下列各項(xiàng)。
3.3. 1 熒光光度計(jì)。
3.3.2 高諫均質(zhì)器.18 000 r/min--22 000 r/min
GB/T 18979-2003
3.3.3 黃曲霉毒索免疫親和柱。
3.3.4 玻璃纖維濾紙:直徑11 cm，孔徑1.5 [am.
3.3.5 玻璃注射器:10 mL,20 mI。
3.3.6 玻璃試管:直徑12 mm，長(zhǎng)75 mm，無(wú)熒光特性。
3.3.7 空氣壓力泵。
3，4 分析步驟
3.4. 1 提取
同 2.4 .1 ,
3.4.2 凈化
同 2. 4. 2,
3.4.3 測(cè)定
3.4.3. 1 熒光光度計(jì)校準(zhǔn)
在 激 發(fā) 波長(zhǎng) 360r an，發(fā)射波長(zhǎng)450n 條件下，以。.05m ol/L硫酸溶液為空白，調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的
讀數(shù)值為 。.。Fag/L;以熒光光度計(jì)校準(zhǔn)溶液(3.2.12)調(diào)節(jié)熒光光度計(jì)的讀數(shù)值為 20.0 F ag/L,
3.4.3.2 樣液測(cè)定
取上 述 凈 化后的甲醇洗脫液加人1.0 m L0 .0 020 o澳 溶液，混勻，靜置1m in，按3.4.3.1條件進(jìn)行
操作，于熒光光度計(jì)中讀取樣液中黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的濃度。(Kg/L)e
3.4.4 空白試驗(yàn)
用 水 代 替試樣，按 3.4.1--3.4 .3 步驟做空白試驗(yàn)。
3.4.5 結(jié)果計(jì)算
樣 品 中 黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量(X2)以微克每千克表示，按式(3)計(jì)算 :
(c:一CD )·V
W
(3 )
其中:
W一V,X V 2
(V2 + V,)
X V, (4)
式中:
X2— 樣品中黃曲霉毒素(B, +殘十G 十G2)含量，單位為微克每千克伽g/kg),
c2— 試樣中黃曲霉毒素(B，十Bz +G,十G )的含量，單位為微克每升(FHB/L) ;
‘。— 空白試驗(yàn)黃曲霉毒素(B,+ B2+ G,+ G2)的含量，單位為微克每升恤B/L);
V— zui終甲醇洗脫液體積，單位為毫升(mL) ;
W— zui終凈化洗脫液所含的試樣質(zhì)量，單位為克(9);
。— 試樣稱(chēng)取的質(zhì)量的數(shù)值，單位為克(9);
V,— 樣品和提取液總體積，單位為毫升(ML) ;
V— 稀釋用樣品濾液體積，單位為毫升(mL) ;
V 稀釋液體積，單位為毫升(mL);
V,— 通過(guò)親和柱的樣品提取液體積，單位為毫升(mL) o
計(jì)算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后一位。
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